在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。關(guān)于細(xì)胞房建設(shè)知識(shí)

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前超凈工作臺(tái)的廣泛使用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、1.無菌操作區(qū)

(1)無菌操作室：無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，zui好能與外界隔離不能穿行或受其他干擾。理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分

a)更衣室一一供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩

b)緩沖間一一位于更衣間與操作間之間，目的是為了 操作間的無菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器

c)無菌操作間一一專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高(不超過2.5m)以 紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑無死角以便清潔和消毒。工作臺(tái)安置不應(yīng)靠墻壁，臺(tái)面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。無菌操作間的空氣消毒：

紫外線燈一一產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康。

空氣過濾的恒溫恒濕裝置一一zui好

無臭氧紫外線消毒器

電子消毒滅菌器一一在高壓電場作用下，電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強(qiáng)烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng)，從而靠臭氧氣體彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的，消毒時(shí)沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30~4min即能自行還原成氧氣，空氣不留異味，消毒物體表面不留殘(2)凈化工作臺(tái)：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺(tái)主要有兩種：a)側(cè)流式或稱垂直式b)外流式或稱水平層流式

凈化工作臺(tái)工作原理(大致相同)一一通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。

側(cè)流式工作臺(tái)一一空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過工作臺(tái)面流向?qū)?cè)，也有從上向下側(cè)流式工作臺(tái)一一空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過工作臺(tái)面流向?qū)?cè)，也有從上向下或從下向上流向?qū)?cè)，形成氣流屏障保持工作區(qū)無菌。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為封閉式。

外流式(水平式)工作臺(tái)—一凈化后的空氣面向操作者流動(dòng)，因而外方氣流不致混入操作，但進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作則對操作者不利。工作臺(tái)結(jié)構(gòu)為開放式(已用)。

凈化工作臺(tái)應(yīng)用注意

(1)凈化工作臺(tái)應(yīng)安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nèi)，以兔塵土過多易使過濾器阻塞，降低凈化效果，縮短其使用壽命

(2)新安裝的或長期未使用的工作臺(tái)，工作前必須對工作臺(tái)和周圍環(huán)境用真空吸塵器或產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進(jìn)行滅菌處理

3)使用凈化工作臺(tái)前，應(yīng)先用75%酒精擦洗臺(tái)面，并提前以紫外線滅菌燈照射30~5omin處理浄化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應(yīng)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。

(4)凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。

5)注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化，一旦感到氣流變?nèi)?，如酒精燈火焰不?dòng)，加大電機(jī)電壓仍未見情況改變則說明濾器己被阻塞，應(yīng)及時(shí)更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次更換高過濾器應(yīng)請專業(yè)人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布(無紡布)應(yīng)定期清洗更換，時(shí)間應(yīng)根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3-6個(gè)月進(jìn)行一次。

(6)凈化工作臺(tái)使用完畢應(yīng)及時(shí)清理工作臺(tái)面上的物品并用酒精擦洗臺(tái)面使之始終保持(7)凈化工作臺(tái)應(yīng)定期進(jìn)行功能測試，檢查凈化工作臺(tái)各項(xiàng)工作指標(biāo)是否達(dá)到要求，例如進(jìn)行無菌試驗(yàn)，定期檢查臺(tái)面空氣的潔凈度是否達(dá)標(biāo)。超凈工作臺(tái)的無菌程度檢査超凈工作臺(tái)在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20m,制成平板，在30~35℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后將平板3個(gè)，以無菌方式帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)左、中、右各放一個(gè)；打開平皿蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30~35℃培養(yǎng)48小時(shí)，取岀檢查，100級清潔度要求：3個(gè)平皿上生長的菌落數(shù)平均不得超過1個(gè)。

超凈工作臺(tái)應(yīng)定期請有關(guān)部門檢查其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級(一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀)檢測塵埃粒徑≤5的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)/升；空氣流量應(yīng)控制在0.75~1.0m3/s;細(xì)菌菌落數(shù)平均<1個(gè)，可根據(jù)無菌狀況必要時(shí)置換過濾器。

2.孵育區(qū)

本區(qū)對無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來主穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行，后者費(fèi)用高，一般實(shí)驗(yàn)室多采用孵箱進(jìn)行工作。

3.制備區(qū)

在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。

4.儲(chǔ)藏區(qū)

主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要淸潔無塵

5.清洗和消毒滅菌區(qū)

清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作

(-)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備

組織細(xì)胞培養(yǎng)室除一般實(shí)驗(yàn)室的普通常規(guī)設(shè)備外，尚有一些特殊需要的設(shè)備?；究煞譃閮纱箢悾旱?一類為常用的基本設(shè)備；第二類為較 的特殊設(shè)備。

常用的基本設(shè)備

(1)儀器

a)顯微鏡：倒置顯微鏡一一是組織細(xì)胞培養(yǎng)室所必需的日常工作常規(guī)使用設(shè)備之

便于掌握細(xì)胞的生長情況并觀察有無污染等。一一若有條件，尚可配置帶有照相系統(tǒng)的高質(zhì)量相差顯微鏡、解剖顯微鏡、熒光顯微鏡、錄像系統(tǒng)或縮時(shí)電影拍攝裝置等，以便隨時(shí)觀察記錄、攝影細(xì)胞生長情況。

b)培養(yǎng)箱：體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞一樣，需要在恒定的溫度下生存，大多數(shù)情況下，zui適溫度是37℃，溫差變化一般不應(yīng)超過±0.5℃，細(xì)胞在溫度升高2℃時(shí)，持續(xù)數(shù)小時(shí)即不能耐受，40℃以上將很快死亡。因此需要有能控制溫度的培養(yǎng)箱，如具有較高靈敏度的恒溫培養(yǎng)箱及CO2培養(yǎng)箱

恒溫培養(yǎng)箱——應(yīng)選隔水式或皛體管自控溫培養(yǎng)箱，此類培養(yǎng)箱靈敏度髙，溫度控制較」穩(wěn)定。一般的恒溫培養(yǎng)箱價(jià)格較便宜，其缺點(diǎn)是只宜于作密閉式培養(yǎng)。

co2培養(yǎng)箱——目前多數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)室已廣泛使用。CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)是能夠提供進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所需要的一定量的αo2(常用濃度為5%)，易于使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用

于開放或半開放培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的器皿可用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶；當(dāng)使用培養(yǎng)瓶時(shí)，可將瓶蓋略微旋松，使培養(yǎng)瓶內(nèi)與外界保持迺氣狀態(tài)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿內(nèi)部與外界相通，培菾箱內(nèi)空氣必須保持清潔，應(yīng)定期以紫外線照射或酒精消毒。同時(shí)培養(yǎng)箱應(yīng)放置盛有無菌蒸餾水的水槽，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)，使箱內(nèi)相對濕度始終保持為10%。

c}干燥箱：用于細(xì)胞垶養(yǎng)箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻珓器皿等須干熱消毒。干熱消毒時(shí)，電熱干燥箱升溫較高，一般需達(dá)到160℃以上。通常使用鼓風(fēng)式電熱干燥箱。其優(yōu)點(diǎn)是溫度均勻、效果較好，缺點(diǎn)是升溫過程較慢。升溫時(shí)不能先升溫后鼓風(fēng)而應(yīng)鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開始，至100℃時(shí)，停止鼓風(fēng)，應(yīng)避免包裹器皿的紙或棉花燒焦，燒焦的碎屑可影響細(xì)胞的生長。消毒后，不能立即打開箱門以免驟冷而導(dǎo)致玻璃器皿損壞，應(yīng)等候溫度自然下降至100℃以下方可開門。

d純化水裝置：細(xì)胞培養(yǎng)對水的質(zhì)量要求較高，細(xì)胞培養(yǎng)以及與細(xì)胞培養(yǎng)工作相關(guān)的液體的配制用水必須事先嚴(yán)格純化處理。水純化時(shí)可采用離子交換裝置或蒸餾器。離子交換純水尚不能有效去除有機(jī)物，因此用水時(shí)尚需再次蒸餾。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用三次蒸餾水：即使是用于玻璃器皿的沖洗，也應(yīng)使用二次以上蒸餾水。目前國內(nèi)使用較多的是自動(dòng)雙重純水蒸餾器(石英管加熱)，使用方便，安全、蒸餾速度快(1600m/h)使用注意不可采用普通自來水蒸餾，以免蒸餾器內(nèi)很快結(jié)成水垢影晌蒸餾效果；同時(shí)，還需視蒸餾器內(nèi)存水垢程度定期徹底淸洗蒸餾器ε正確的使用方法是將經(jīng)金屬蒸餾器蒸餾的蒸餾水加入玻璃蒸餾器內(nèi)進(jìn)行再次蒸餾。般配制培養(yǎng)液的用水應(yīng)在配液前蒸餾，不宜使用存放數(shù)日的三蒸水，以免影響培養(yǎng)用水的質(zhì)量。目前市場上供應(yīng)的是含有各種級別和類型的采用一種或多種純化方法相結(jié)合的使普通水純化為純水和超純水的純水系統(tǒng)可供選擇。例如：設(shè)計(jì)靈活的可以掛壁、也可為臺(tái)式，也可以有儲(chǔ)水箱、也可直接用分液槍的純水裝置；還可根據(jù)各類實(shí)驗(yàn)用水需求選擇配備有效殺菌或去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，甚至可有效去除掉熱源、內(nèi)毒素的超濾型純水器。e)冰箱：細(xì)胞培養(yǎng)室必須配備

a普通冰箱或冷藏柜儲(chǔ)存培養(yǎng)液、生理鹽水、 Hanks液試劑等培養(yǎng)用的物品及短期保存組織標(biāo)本

b低溫冰箱(-20℃)、超低溫冰箱

用于儲(chǔ)存需要冷凍保存生物活性及較長時(shí)期存放的制劑，如酶、血清等。細(xì)胞培養(yǎng)室的冰箱應(yīng)屬專用，不得存放易揮發(fā)、易燃燒等對細(xì)胞有害的物質(zhì)，且應(yīng)保持清潔

f)細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器：儲(chǔ)存器常用的是液氮容器。根據(jù)使用需要分為不同的類型及多種規(guī)格。

選擇購置液氮容器時(shí)要綜合考慮容積大小，取放使用方便及液氮揮發(fā)量(經(jīng)濟(jì))三種因素。液氮容器的大小可自25L~500L,可以儲(chǔ)存1m的安瓿250~1500個(gè)左右。液氮溫度可低達(dá)-196℃，使用時(shí)應(yīng)防止凍傷。由于液氮不斷揮發(fā)，應(yīng)注意觀察存留液氮情況，及時(shí)定期補(bǔ)充液氮，避兔揮發(fā)過多而致細(xì)胞受損目前，國內(nèi)各類實(shí)驗(yàn)室已廣泛使用新型的細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器。市場所提供的各種新型的細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存器具有性能優(yōu)異，使用方便等特點(diǎn)。例如：可通過 的電子控制器實(shí)現(xiàn)凍存自動(dòng)化并監(jiān)測液氮水平和樣品溫度， 樣品溫度始終處于設(shè)定溫度點(diǎn)；可配備 的報(bào)警系統(tǒng)，分別警報(bào)液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況同時(shí)具備熱氣體旁路系統(tǒng)，防止高于-130℃的暖空氣進(jìn)入液氮罐，從而更有效地保護(hù)樣品，防止升溫另外，多種規(guī)格的 液氮運(yùn)輸，供應(yīng)罐系列不僅移動(dòng)方便，還可通過連接管給儲(chǔ)存罐補(bǔ)充液氮，提高工作效率， 樣品安全

g)離心杋：進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，常規(guī)需要進(jìn)行制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度、洗滌、收集細(xì)胞等工作，通常需要使用離心機(jī)a一般可常規(guī)配置4000pm的國產(chǎn)臺(tái)式離心機(jī)，例如細(xì)胞沉降，使用80~100g的離心機(jī)即可，離心力過大有時(shí)可能引起細(xì)胞的損傷

b另外，可根據(jù)需嬰添置其他類型如大容量或可調(diào)節(jié)溫度的離心機(jī)等

c若需特殊用途，例如某些細(xì)胞的分離制備需梯度離心，則需另行配置實(shí)驗(yàn)所需的具備其他特殊功能的離心機(jī)。

h)天平：常用的有扭力天平、精密天平及各種電子天平。

分析天平的感量為0.1mg、0.01mg和o.001mg。根據(jù)稱取物質(zhì)的量和稱量精度的要求選擇適宜級別的天平。要求精密稱定時(shí)，當(dāng)取樣量大于100mg選用感量為0.1mg天平，在100-10mg選用感量為001mg天平，小于10mg選用感量為0.001mg天平消毒器：直接或間接與細(xì)胞接觸的物酤均需消毒滅菌處理。常用：

a。手提式高壓蒸汽消毒器

b。目前市場上，具有高效、安全、方便等性能，適用于各種器皿、液體、培養(yǎng)基的高壓滅菌裝置己在流通(如脈動(dòng)真空滅菌器)。可供使用者在滅菌的同時(shí)監(jiān)測滅菌容器內(nèi)的壓力和溫度， 滅菌質(zhì)量和安全，并可邇過記憶(儲(chǔ)存)支持系統(tǒng)改變各種參數(shù)(例如滅菌、排氣、加熱等參數(shù))，即使在進(jìn)行滅菌時(shí)發(fā)生停電故障，仍可保留所設(shè)定的參數(shù)

j)濾器：目前細(xì)胞培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細(xì)菌目前常使用的濾器有zeis濾器、璃濾器和微孔濾器，各種濾器有其使用原理和特點(diǎn)(后詳述)。

(2)培養(yǎng)用器皿

a)培養(yǎng)器皿：供細(xì)胞接種、生長等用的器皿，可由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃或無毒而透明光滑的特制塑料制成

a)玻璃培養(yǎng)器皿的優(yōu)點(diǎn)是多數(shù)細(xì)胞均可生長，易于清洗、消毒，可反復(fù)使用，并且透明而便于觀察；缺點(diǎn)是易碎，清洗時(shí)費(fèi)人力

(b)塑料制培養(yǎng)器皿的優(yōu)點(diǎn)是一次性使用，廠家已消毒滅菌密封包裝，打開即可用于細(xì)胞

培養(yǎng)操作建設(shè)方案之動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室在生命科學(xué)科領(lǐng)域中細(xì)胞學(xué)有著至關(guān)重要的地位，近年來細(xì)胞學(xué)發(fā)展迅速，并取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，細(xì)胞學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)也是各個(gè)研究院及院校生物學(xué)科必備的實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)所需儀器及耗材種類繁多，接下來就細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用儀器作下簡單介紹：、純水系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)用水一般要求雙蒸水(08MΩ以上)，實(shí)際上普通蒸餾水經(jīng)玻璃器皿中按標(biāo)準(zhǔn)方法蒸餾二次得到的雙蒸水是不能滿足要求的，而且水中的內(nèi)毒素直接參與細(xì)胞凋亡，血淸中

內(nèi)毒素含量越低，對細(xì)胞毒性越小，越利于細(xì)胞的生長和傳代；內(nèi)毒素含量過高，會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞提前老化。因此建議配置正式的水純化系統(tǒng)。液氮罐為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般為液氮溫度-196℃，因此，需要液氮罐。在此環(huán)境中，一般細(xì)胞可以保存十年具有活性超凈工作臺(tái)/生物安全柱細(xì)胞培養(yǎng)對無菌環(huán)境要求很高，在細(xì)胞操作時(shí)，一般需要在100級空氣質(zhì)量條件下進(jìn)行，因此超凈工作臺(tái)或生物安全柜就必須配備

四、co2培養(yǎng)箱

CO2培養(yǎng)箱是細(xì)胞培養(yǎng)的必備儀器，它為細(xì)胞提供了一個(gè)體外培養(yǎng)的舒適環(huán)境，如適宜的溫度、濕度、酸堿度、O2濃度等。細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)很容易受到各種細(xì)菌、微生物的感染，因此，CO2培養(yǎng)箱的滅菌和抑菌能力就顯得尤為重要。

五、恒溫水浴

從液氮或超低溫冰箱中取岀細(xì)胞凍存管需要立即放于37℃水浴中快速復(fù)蘇之后才傳代培養(yǎng)，

因此，恒溫水浴也是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室必備儀器。

、超低溫冰箱細(xì)胞的凍存過程需要一系列程序降溫，一般4℃下存放30min轉(zhuǎn)放-20℃1houJ再轉(zhuǎn)入至-80℃過夜，之后才可以轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(196℃)，這時(shí)就必須配備一臺(tái)-86℃超低溫冰箱。一般超低溫冰箱保存細(xì)胞可達(dá)數(shù)月，對于不需要長期凍存的細(xì)胞，可暫時(shí)放于超低溫冰箱保存。

七、離心機(jī)

細(xì)胞培養(yǎng)需要離心收集傳代細(xì)胞，所以需要配置低速的常溫離心機(jī)，對于后期細(xì)胞內(nèi)容物的分離則需要高速冷凍離心機(jī)

八、移液器和細(xì)胞培養(yǎng)的大量耗材

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中有大量頻繁的移液操作，因此各種微量移液器、瓶口分配器、移液管控制器是必不可少的。各類細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管等耗材更是不可或缺的，而且一次性，用量極大除上述儀器外，高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡也是細(xì)胞培養(yǎng)的必備儀器，發(fā)酵罐、轉(zhuǎn)瓶機(jī)等也常常見于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室